Pagina Principal

Abstracto • Introducción • Materiales y Métodos • Resultados y Discusión

Scavenging Effects of FRC001 China No.1 Tian Xian Liquid on Oxygen Free Radicals

Ba-Lu Zhao1 Ph.D., Wen-Juan Xin 1 Ph.D., Chung-Yu Kao2 MD, Hong Zhang3 MD. Ph.D.
1. Institute of Biophysics, Academia Sinica, Beijing
2. FRC Free Radical Biology and Medical Research Center, Taipei
3. Department of Pathology, Univewrsity of Linkoping, Sweden

Abstracto :
Utilizando la VSE, quimioluminosidad-BJL y otras técnicas, se estudió el efecto necrofágico del FRC001 sobre radicales libres de oxigeno en sistemas celulares, acuosos enzimáticos e irradiados y fueron comparados con las Vitaminas C y E. Se encontró que el FRC001 es eficaz para la necrofágia de radicales libres de oxigeno generas por polimorfonucleares estimulados con PMA, xantina, oxidasa de xantina, irradiación, riboflavina/EDTA y la Reacción de Fenton. También se encontró que podía inhibir los diones conjugados y materiales que han tenido una reacción con TBA, (TBARM) formado durante la peroxidación lípida del ácido linoleico y liposoma respectivamente y es eficaz para la necrofágia de ONOO.

Palabras clave: FRC001, radicales libres de oxigeno, peroxidación lípida, VSE, quimioluninosidad-BJL

Introducción
Radicales libres de oxigeno activos pueden dañar los componentes de la célula, aún matar células normales , causar envejecimiento y algunas enfermedades muy serias, tales como cáncer y enfermedades cardiacas. Generalmente la producción y la necrofágia de los radicales libres de oxigeno activos están balanceados en el cuerpo humano sano. Si hay un desbalance en el mecanismo regular de algunos enzimas, tales como la dismutasa superoxido (SOD) o catalasa, pueden haber cantidades excesivas de radicales de oxigeno libres generados en el cuerpo. Es posible que los necrófagos de radicales de oxigeno activos puedan ser de beneficio para la prevención de tales enfermedades y para la salud del humano. Así que es muy importante buscar necrófagos efectivos de radicales activos de oxigeno. En este estudio, utilizando la VSE, quimioluminosidad-BJL y otras técnicas, se estudió el efecto necrofágico del FRC001 sobre radicales libres de oxigeno en sistemas celulares, acuosos enzimáticos e irradiados. Se encontró que el FRC001 es efectivo para la necrofágia de los radicales libres de oxigeno generados por polimorfonucleares estimulados con PMA, xantina, oxidasa de xantina, irradiación, riboflavina/EDTA y la Reacción de Fenton. También se encontró que podía inhibir los diones conjugados y TBARM formado durante la peroxidación lípida del ácido linoleico y liposoma respectivamente.

Go back to TOP.

Materiales y Métodos
agentes DMPO (5,5-dimetil-pirrolina-1-oxido) se compro de Sigma Chem Co. Y purificado con carbon activado antes de ser utilizado. PMA (forbol miristato acetato), ácido linoleico, lipoxidasa, SOD (6500U/mg), xantina/xantina oxidasa (2.125 U/ml) y luminol también se compraron a Sigma Chem Co. Se disolvió el PMA en un poco de acetona y diluido con 50mM de ______fosfato hasta una concentración apropiada antes de ser usada. Otros agentes producidos en China son Niveles AR. La medida de la actividad de SOD fue incluida en FRC001.

Medida de quimioluminosidad-BJL: La reacción de xantina y xantina oxidasa puede generar radicales libres de oxigeno que dan una quimioluminosidad dependiente-de-luminol. SOD puede necrofagar la quimioluminosidad generada por este sistema, por lo tanto la actividad de SOD puede ser medida con este sistema. El sistema de medidas incluye 0.2 mM luminol, 0.32 mM xantina, y 0.09 U/ml de xantina oxidasa. Se mido la quimioluminosidad con el quimioluminosidadometro WDD-1.

Se define el efecto necrofágico del FRC001 en O2 como:

E = [(ho-hx)/ho] X 100%

Ho es la quimioluminosidad del sistema de control de xantina/xantina oxidasa después de añadir solución FRC001.

El sistema de medidas fue el mismo que el mencionado antes, excepto que se añadieron concentraciones diferentes de FRC001 al sistema. Primeramente se desarrollo una curva standard de actividad SOD dentro de este sistema. Luego se midió la curva del efecto necrofágico del FRC001 sobre los radicales libres de oxigeno con este sistema. Utilizando ambas curvas, la actividad SOD incluida en solución FRC001 puede ser determinada

El efecto necrofágico del FRC001 sobre radicales libres de oxigeno generados de la Reacción de Fenton.

Una solución de 50mM DMPO 1% H2O2 y 100 mM Fe(II) como sulfato de amonia ferroso se mezclaron y transfirieron a un tubo capilar para medidas de la VSE. Cuando se midió el efecto necrofágico del FRC001 se añadieron diferentes concentraciones de FRC001 al sistema. El efecto necrofágico se calculo como se menciono antes pero aquí la altura del segundo pico se utilizo para el calculo. Condiciones VSE: Todos los espectros del VSE fueron registrados con un espectrómetro VSE Varian E-109. Las condiciones son: potencia microondas 20mW, banda-X, modulación 100kHz con amplitud 1G, campo magnético central 3250 G, anchura de scan 200 G, constante de tiempo 0.128S, temperatura de ambiente.

Efecto necrofágico del FRC001 sobre O2 generado por la irradiación del sistema riboflavina/EDTA.

Una mezcla de 0.3 mM de riboflavina, 5 mM de EDTA y 0.1 M DMPO fue trasladada a un tubo capilar de cuarzo y colocado en el espectrometro VSE. Luego de irradiar la muestra por 20 segundos con una lampara de xenon, (500 W, a 70 cm de distancia), se registraron de inmediato las medidas del espectro del VSE. Cuando se midió el efecto necrofágico del FRC001, se añadieron distintas concentraciones de FRC001al sistema. Se calculó el efecto necrofágico como mencionado antes, pero aquí se uso la altura del primer pico para los cálculos. Las condiciones de la medida del VSE eran iguales a las anteriores.

Medida del efecto necrofágico del FRC001 sobre dienos conjugados generados por la peroxidación lípida del ácido linoleico por lipoxidasa.

Se mezclaron 0.1 mM de ácido linoleico en PBS con 480U/ml de lipoxidasa y medido a 232 nm con el tiempo. Cuando se midieron los efectos inhibitorios del FRC001 sobre la generacion de dienos conjugados, se añadieron distintas concentraciones del FRC001 al sistema. El efecto necrofágico fue calculado como se mencionó antes, pero aquí la h y la hx se uso por la tasa de reacción por el control y la muestra respectivamente.

Tasa de medida del efecto necrofágico sobre materiales que han reaccionado al TBA (TBARM) generados de la peroxidación lípida del liposoma iniciado por Fe2+.

Liposoma hecho de lecitina (10 mg/ml) fue peroxidado por adición de Fe2+(100 mM), luego calentado a 95ºC mezclado con 6.7 mg/ml TBA y 0.05 M Cl. Luego se incubo la muestra durante 60 minutos a 95ºC. Luego enfriado hasta temperatura ambiente. Se extrajo el TBARM por butanol:metanol (85:15) y medido a 532 nm. Cuando se midieron los efectos inhibitorios del FRC001, se agregaron diferentes concentraciones de FRC001 al sistema. Se calculó el efecto necrofágico como se hizo anteriormente.

El efecto necrofágico del FRC001 sobre los radicales libres de oxigeno generados del PMN estimulados por PMA.

Aislamiento de PMN: Se compró sangre entera fresca de un donante sano del Centro de Sangre de la Cruz Roja de Beijing. Los PMN fueron separados de los demás componentes celulares utilizando sedimentación con dextran al 6%, lisis hipersónica de las células rojas remanentes y separación de las células mononucleares por la centrifugacion de gradientes de densidad de Ficoll.

Producción y medida de radicales libres activos de oxigeno generados de PMN estimulados por PMA:

En un experimento típico, una mezcla que contiene 107 PMN/ml, 0.1mM de DETAPAC (ácido dietilentriaminopentacético) y 100ng/ml de PMA se incubo por 2 minutos a 37ºC, luego se le añadió 0.1 de luminal y se mezcló en forma homogénea antes de medirse con quimioluminiscencia-BJL. Cuando se midieron los efectos inhibitorios del FRC001, se agregaron diferentes concentraciones de FRC001 al sistema. Se calculó el efecto necrofágico como se hizo anteriormente.

El efecto necrofágico del FRC001 sobre el ONOO

Síntesis de peroxinitrito: Se realizo la síntesis de peroxinitrito en un reactor de flujo saturado {12}. Soluciones de (i) NaNO2 0.5 mol/L, y (ii) 0.6 mol/L de HCl/0.7 mol/L de H2O2 fueron bombeadas a 26ml/min a un conector en T y mezcladas en un tubo de vidrio de 3mm de diámetro por 2.5 cm. La reacción de canalización del ácido nitroso con H2O2 para formar ácido peroxinitroso fue alimentada por medio del b bombeo de 15 mol/L de NaOH a la misma razón de flujo a una conexión en T al final del tubo de vidrio. El exceso de H2O2 se saco pasándolo sobre una columna de 1x5cm llenada con 4 gramos de MnO2 granulado. Se congeló la solución por una semana a -20ºC. El peroxinitrito puede oxidar luminol y dar una fuerte quimioluminosidad. El efecto necrofágico del FRC001 sobre el peroxinitrito se midió por el método de quimioluminosidad y el efecto necrofágico se calculo como se hizo antes.

Go back to TOP.

Resultados y Discusión

1. Efectos necrofágicos del FRC001 sobre los radicales libres de oxigeno generados del sistema xantina/xantina oxidasa.
2. Una curva del efecto necrófago del SOD sobre los radicales libres generados de xantina/xantina oxidasa se ve en la Figura 1.



Actividad SOD (U/ml)

Figura 1. La curva standard del efecto necrofágico del SOD sobre radicales libres de oxigeno generado de la reacción del sistema xantina/xantina oxidasa.

3. El efecto necrofágico del FRC001 sobre los radicales libres de oxigeno generados del sistema xantina/xantina oxidasa se vio en la Figura 2.

Figura 2. El efecto necrofágico del FRC001 sobre los radicales libres de oxigeno generados del sistema xantina/xantina oxidasa.

De la información generada por las dos curvas anteriores, se puede ver que LA ACITIVIDAD INCLUIDA EN 1G frc001 SE CALCULA QUE SEA DE 300,000 U/ml.

Los efectos necrofágicos del FRC001 sobre los radicales libres generados de PMN estimulados con PMA.

4. Cuando los PMN son estimulados o están dentro de los fagocitos, habrá una descarga respiratoria y la producción de los radicales libres de oxigeno activos. Los radicales activos de oxigeno producidos en este proceso desempeñan un papel importante en procesos microbicidas y tumoricidas y para proteger el cuerpo sano de enfermedades. Pero si hay un exceso de radicales activos de oxigeno en el cuerpo , dañaran los componentes de las células y mataran células normales y causaran envejecimiento y enfermedades muy serias como enfermedades del corazón y cáncer. Aquí fue usado para examinar el efecto del FRC001 sobre los radicales libres de oxigeno. La figura 3 muestra los efectos necrofágicos del FRC001 sobre los radicales libres generados de PMN estimulados con PMA y medidos por quimioluminiscencia-BJL. Se determino que el C50 = 0.62 mg/ml el cual es mayor que el de la Vitamina C (C50 = 0.2 mg/ml) y menor al de la Vitamina E

Figura 3. El efecto necrofágico del FRC001 sobre los radicales libres generados de PMN estimulados con PMA.

5. Efecto necrofágico del FRC001 sobre radicales libres de OH generados de la Reacción de Fenton.
6. La Reacción de Fenton puede generar OH y se ha usado para examinar necrófagos de radicales libres de OH.

H2O2 + Fe2+ a. OH+OH- + Fe3+

Aquí se utilizo para el examen del efecto necrófago del FRC001 sobre radicales libres de OH. El espectro VSE del DMPO-OH se vio en la Figura 4b (an=ah=14.9G).

El efecto necrofágico del FRC001 sobre OH se vio en la Figura 5.

Figura 4. El espectro VSE de la rotación del DMPO atrapó el O2 generado del sistema irradiado de riboflavina/EDTA (a) y radicales libres de OH generados de la Reacción de Fenton (b).

El efecto necrofágico del FRC001 que se vio en la Figuras 4 y 5 demostró que el FRC001 puede necrofagar los radicales libres de hidroxilo generados de la Reacción de Fenton, pero la Vitamina C solo tiene poco efecto necrofágico sobre el radical libre de hidroxilo. La Vitamina E solo tuvo efecto necrófago del 37.5% a la concentración de 5mg/ml.

Figura 5. Efecto necrófago del FRC001 sobre radicales libres de OH generados de la Reacción de Fenton.

7. Efecto necrófago del FRC001 sobre O2 generado del sistema irradiado riboflavina/EDTA.

8. Riboflavina/EDTA irradiado se ha utilizado para la generacion de O2 y para examinar la necrofágia del O2 en un sistema foto. Aquí se utilizó para examinar el efecto necrofagico del FRC001 sobre el O2. El espectro VSE sobre el giro del O2 aduce CMPO-OOH generado de la riboflavina irradiada se mostró en la figura 4 a (an=14.3, ahb=11.3G, ahg=1.25G)

De acuerdo con la definición del efecto necrofágico, la curva del efecto necrofágico del FRC001 sobre el O2 generado del sistema irradiado de riboflavina/EDTA se ve en la Figura 6. La concentración del FRC001 para necrofágia del 50% es aproximadamente 17mg/ml. Su efecto necrofágico es menor al de la Vitamina C (C50=0.0009 mg/ml) pero mayor al de la Vitamina E.



Figura 6. Los efectos necrofágicos del FRC001 sobre el O2 generado del sistema irradiado riboflavina/EDTA.

9. Efecto inhibitorio del FRC001 sobre los diones conjugados que son generados de la peroxidación lípida del Acido Linoleico por la lipoxidasa.
10. Diones conjugados fueron generados en el primer paso de la peroxidación lípida que tiene absorción a los 233nm. El efecto inhibitorio del FRC001 sobre la generacion de diones conjugados de la peroxidación del ácido linléico catalizado por lipoxidasa se vieron en la Figura 7. De las curvas se encuentra que los efectos inhibitorios fueron incrementados con las concentraciones del FRC001 añadidos al sistema. Cuando la concentración del FRC001 fue de 0.35mg/ml hubo una necrofágia del 20% de los diones conjugados. Cuando aumentó la concentración, la absorción a los 233nm también aumento, lo cual afecto la determinación a altas concentraciones.

Figura 6. Los efectos necrofágicos del FRC001 sobre el O2 generado del sistema irradiado riboflavina/EDTA.

11. Efectos inhibitorios del FRC001 sobre los materiales que han reaccionados con TEA (TBARM) generados de la peroxidación del liposoma.
12. Los efectos inhibitorios del FRC001 sobre los materiales de reacción TBA generados de la peroxidación del liposoma se ven en la Figura 7. De la curva se puede ver que el efecto inhibitorio sobre el TBARM aumento con el aumento de la concentración del FRC001. La concentración para la inhibición del 50% es aproximadamente 19mg/ml. El efecto inhibitorio de los materiales de reacción TBA es menor al de la Vitamina C (C50=1mg/ml) pero mayor al de la Vitamina E.

Figura 7 Efectos inhibitorios del FRC001 sobre TBARM generado por la peroxidación lípida del liposoma iniciado por Fe2+.

13. Efecto necrofágico del FRC001 sobre peroxinitrito.

El ácido nítrico tiene muchas funciones bio0logicas, tales como el factor relajante derivado del endotelio (EDRS) el cual puede relajar la musculatura vascular lisa e inhibir la coagulación plaquetaria y revertir la transmision de la neurona mensajera. La biosíntesis del oxido nítrico de L-argininapuede ser un camino metabólico para la regulación de la función y comunicación celular. Los macrofagos producen oxido nítrico como parte de sus armamentos citotóxicos. Por otro lado, el oxido nítrico, que contiene un electrón suelto, es un radical libre paramagnético y activo, puede reaccionar con O2 para formar el anión peroxinitrito (ONOO-). En soluciones alcalinas ONOO- es estable pero tiene un pKa de 6.6 a 0 C y se descompone rápidamente una vez que es protonado, para dar lugar a una especie parecida a radicales de hidroxilo y radicales libres de NO2 respectivamente de acuerdo con la siguiente reacción.

O2+ NO á ONOO- + H+ á ONOOH á. OH + NO2

Recientemente se propuso que el óxido nítrico reacciona con O2 en muchos casos patológicos para rendir especies citotóxicas. La investigación del peroxinitrito ha recibido mucha atención. Su oxidación de sulfhidrilos y membranas lípidas, que causan toxicidad celular y algunas enfermedades. Aquí el efecto necrofágico del FRC001 sobre ONOO- se midió y se demostró en la Figura 8. Se puede encontrar que el FRC001 puede ser un necrofágico efectivo del ONOO- (C50=0.03mg/ml). Su efecto necrofágico sobre el peroxinitrito es menor al de la Vitamina C (C50=).00003mg/ml) pero mayor al de la Vitamina E.

FRC001 es un medicamento diseñado en base a la teoría de la necrofágia de los radicales libres. De los resultados de este experimento se puede ver que el FRC001 es un necrofágico efectivo de los radicales libres del oxigeno generados de los PMN estimulados con PMA xantina/xantina oxidasa, riboflavina/EDTA irradiada y la Reacción de Fenton que se forman durante la peroxidación del ácido linoleico y liposomas respectivamente y necrofagar ONOO-. Estos resultados sugieren que el efecto terapéutico del FRC001 sobre las enfermedades, puede pasar por el camino de necrofagar radicales libres de oxigeno en todo el cuerpo.

back to top