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Abstracto • Historia • Materiales y Métodos •Resultados y Discusión •Referencias

Robert W. Bradford D. Sc.1
Kexiang Ding 2
1. Bradford Research Institute, CA, USA
Professor of Capital University, Washington DC
2. FRC Free Radical Biology & Medical Research Center

Abstracto

Este trabajo investigó el efecto del FRC001 sobre la inmunidad inespecífica de ratones y la reacción injerto versus huésped (GVHR). Los resultados demuestran que el FRC001 tuvo cierto efecto sobre la función fagocítica del macrófago mononuclear, el índice del bazo y el índice del timo, transformación linfocitaria del bazo, formación hemolizante del suero, el coeficiente de la reacción del bazo del huésped y coeficiente de estimulación y el índice de estimulación, por ejemplo FRC001 puede aumentar y ayudar la inmunidad humoral y celular en una base experimental para el uso del FRC001 para regular la inmunidad y prevenir y curar tumores.

Palabra Clave: FRC001 Inmunidad Inespecífica de la reacción injerto versus huésped (GVHR)

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Historia

La formación de tumores se relaciona a la deficiencia inmunológica. En los últimos años ha habido muchos reportes de el índice de deficiencia inmunológica la cual se considero ser un índice importante en la selección de agentes antitumorales. El estudio investigo el efecto del FRC001 sobre la inmunidad inespecífica de ratones y GVHR.

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Materiales y Métodos

Materiales

1. Medicamento: FRC001.

1.2Animales Experimentales: Ratones, especie Kumming, 18~22gm, mitad machos, y mitad hembras, proporcionados por el Experimental Animal Center of Jiangsu Tumor Prophylactico-therapeutic Research Institute.

Método

2.1 Función fagocítica de macrófagos mononucleares (prueba de eliminación del carbón)

2.1.1 Principios experimentales

Ratones experimentales fueron inyectados con tinta India el cual se uso como un cuerpo extraño granular. La tinta India fue fagocitada y eliminada por macrófagos mononucleares después de entrar en circulación. El 90% fue fagocitado por las células hepáticas de Kupffer mientras que el restante fue fagocitado por los macrófagos del bazo. La tasa de eliminación de cuerpos extraños en la circulación refleja la función fagocítica del macrófago mononuclear. Dentro de ciertos alcances, la tasa de eliminación del cuerpo extraño granular tuvo una relación exponencial con respecto a la concentración granular en circulación. Tiene una relación lineal en un sistema de coordinadas en las cuales tiempo es la horizontal y la concentración granular el la vertical. La inclinación K de la línea es la tasa de fagocitosis (tasa de eliminación)

2. Manipulación

Los ratones fueron separados al azar en un grupo de control negativo y otro grupo de control positivo y grupos de distintas dosis de FRC001. Fueron alimentados con agua destilada, leche elemental y distintas dosis de FRC001 por 10 días. Cada ratón recibió una inyección de tinta India (diluida 1~5 veces) 0.05ml/1.0Gm de peso por la vena de la cola 30 minutos después de comer. En el primer minuto (t1) y el 5to minuto (t5) después de la inyección, se extrajo 20 ml de sangre de la vena postorbital con un tubo de succión humedecido con solución heparina y diluido en 2ml de solución de bicarbonato de sodio al 0.1%. Se midió la absorción de la solución sanguínea a los 680nm. Para calcular el valor de K se utilizo la siguiente formula (lGAl-lGA5)/(t5-t1)=(lGA1/A5)/4

1. Prueba GHVR. Dos ratones de línea pura C57BL JCR hibridizados para dar a luz a ratones recién nacidos y el padre experimental fueron alimentados con FRC001 por 10 días mientras que el padre control no recibió tratamiento alguno. En el día 11 de vida los padres fueron sacrificados para extraer los bazos. La suspensión (1X10 8/ml) se preparo con técnica aséptica. Los ratones recién nacidos fueron divididos en grupos experimental, control y normal. Los ratones recién nacidos del grupo experimental fueron inoculados con 0.1 ml de una suspensión de células de bazo del padre, los ratones recién nacidos del grupo control fueron inoculados con 0.1 ml de una suspensión de células de bazo del padre, y el grupo normal no recibió tratamiento alguno. Todos estos ratones recién nacidos fueron sacrificados al 7mo día después de la inoculación, y sus bazos fueron pesados para calcular el coeficiente de bazo (mg. de bazo/10mg de peso). Luego se calculó el índice de estimulación del bazo (SI) por la siguiente formula: SI=Coeficiente del promedio del bazo del experimental o control/promedio del coeficiente del bazo del grupo normal. El índice del bazo

Prueba del índice del bazo y del timo. Ratones de la especie Kunming (18~22Gm) se dividieron al azar en un grupo control (alimentado con N>S) grupo de control positivo y el grupo FRC001. Fueron alimentados con el alimento respectivo por diez días consecutivos y sacrificados por desangrado orbital al segundo día de la ultima comida. Sus bazos y timos fueron extraídos y pesados exactamente con una balanza de torsión. Los resultados revelaron el índice del órgano(bazo o timo) /peso (mg/10mg de peso corporal).

Prueba de transformación linfocitaria del ratón (MTT) - Colorimetría del MTT del bazo del ratón. Especies puras del ratón Kunming fueron sacrificados por desangrado orbital y los bazos extraídos para hacer una suspensión celular 5 X 10 (8)/ml de suspensión celular con la solución de Hank y suspensión de células medianas RPC 1640. Se pusieron 100 ml al poro de un plato de cultivo y a cada poro se le agrego 100 ml de PHA; mientras tanto se coloco el poro de control. Fueron cultivados a 37-38.5°C. en un incubador CO2 por 72 horas. A cada poro se le agrego 50 ml de MTT 4-5 horas antes de terminar el cultivo, luego continuar con los cultivos 24, 36 y 48 horas respectivamente. Se pusieron en un refrigerador a 4°C por una noche. Se retiraron 150 m. del supernatante al que se le agregó150 ml de isopropanol y mezclado hasta tener una solución homogénea. La absorción (A) de cada tubo fue medido a 630 nm del fotómetro ELISA. Para detalles vea la referencia 10.

Prueba de hemólisis del suero.- Ratones de la especie Kunming de 18~22 gm fueron divididos al azar en grupos no-inmunológicos, inmunológicos; y grupos inmunológicos con droga (dosis baja, media y alta). A cada ratón de los últimos dos grupos se les inyecto intraperitonealmente 0.2 ml de glóbulos rojos de oveja (SRBC) lo cual lo diluyó a 3:5 (V/V) con Ratones NS del Grupo de droga a los cuales se les dio la droga antes o después de la inmunización. Cuatro días después de la inmunización, se saco 1ml para obtener el suero. Para mas detalles vea la referencia 8.

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Resultados y Discusión

1. El efecto del FRC001 sobre la función fagocitaria de el macrófago mononuclear in Ratones

Figura 1.- La curva del efecto de FRC001 sobre la Función Fagocitaria del Macrófago Mononuclear en ratones. El aumento del índice de eliminación del carbón (K) refleja las mejoras de la función fagocitaria del macrófago mononuclear y la inmunidad inespecífica. De acuerdo con la Figura 1 dosis bajas, mediana y altas del FRC001 aumentaron el valor de K significativamente (p<0.01). El resultado muestra que el FRC001 puede aumentar la función fagocitaria del macrófago mononuclear y la inmunidad inespecífica.

2. El efecto del FRC001 sobre el índice del bazo y el índice del timo. (Tabla 1)

Comparado con control * P>0.05, *** P<0.01

Tabla 1 El efecto del FRC001 sobre el índice del bazo (SI) y el índice del timo (TI)

El bazo y el timo son órganos inmunológicos importantes. La degeneración y atrofia de ellos influye sobre su función normal. De acuerdo con la Tabla 1, FRC001 tuvo un efecto insignificante sobre SI y TI (p>0.05). el resultado enseño que Edfrann no tuvo influencia evidente sobre los órganos inmunológicos. Los autores piensan que se deba a la hora de la inyección.

3. Efecto del FRC001 sobre la transformación linfocítica del bazo en el ratón. (figura 2)

Figura 2. El efecto del FRC001 sobre la transformación linfocítica del bazo en el ratón.

La transformación linfocítica del bazo refleja la función inmunológica celular. La transformación linfocítica aumentó con el tiempo. La amplitud en aumento entre la hora 26 y la 48 fue la mayor. Comparado con el control, la transformación linfocítica a las 24, 36 y 48 horas tuvo un aumento significativo (P;0.01). El resultado mostró que el FRC001 puede aumentar la función inmunológica celular.

4. El efecto del FRC001 sobre la hemolisina de suero (Fig. 3)

Figura 3. La curva de efecto del FRC001 sobre la formación de hemolisina en suero.

La hemolisina (IgM) refleja la inmunidad humoral. El aumento de tiempo medio de la absorción de hemolisina (HC50) muestra el aumento de la hemolisina y el aumento de la inmunidad humoral. De acuerdo a la Fig. 3 el HC50 aumento gradualmente con el aumento en FRC001. La diferencia entre los grupos experimental y control fue significativa (P;0.01). El resultado mostró que Edfrann aumento la inmunidad humoral.

5. Efecto del FRC001 sobre el GVHR en ratones (Tabla2)

Comparado con el grupo FRC001, * P>0.05, ** P<0.05, *** P<0.01

Tabla 2. El efecto del FRC001 sobre GVHR en ratones.

GVHR refleja la función inmunológica celular por el índice de la reacción del huésped y también el índice de estimulación. De acuerdo con la Tabla 2, el índice de reacción del huésped y el índice del estimulo del grupo FRC001 fue obviamente mayor al grupo normal (sin tratamiento) y el grupo control (alimentado solo con agua destilada) (P<0.05 o P<0.01). Los resultados muestran que Edfrann puede aumentar y mejorar la función inmunológica celular.FRC001 tiene alguna influencia en la inmunidad inespecífica de los ratones experimentales. La función reguladora del FRC001 sobre la inmunidad puede estar relacionado a sus componentes. Se ha reportado que las medicinas Chinas que tienen la función de fortalecer el Ki, calentamiento de la sangre y del Yang, etc. Contienen muchos componentes bioactivos que pueden mejorar la función del sistema reticuloendotelial, la formación de anticuerpos, inmunidad especifica e inespecífica. Además, la eliminación de radicales libres por los componentes de la medicina china tiene una función colaboradora para proteger los órganos inmunológicos, regulan la inmunidad, favorecen factores inmunológicos, etc. FRC001 tiene componentes que pueden fortalecer el Ki y la sangre, calentar la sangre y eliminar radicales libres. Los componentes que desempeñan un papel para regular la inmunidad y su intensidad de acción y sus mejores efectos biológicos deberán ser estudiados mas en el futuro.

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Referencias

1. Yu He, et al. Tumor and immunity, Shanghai Science and Technology Press, 1982, 114.
2. Cai Limian, tang Zhagyou, Study on Growth Condition of Primary Carcinoma of Liver and Host Macrophage Activity, 1989, 8(4):264.
3. Yang Guizheng, Xu Yiping, Lymphocyte Function Test, Clinical Immunologic Technology, Shanghai Science and Technology Press, 1982:314.
4. Wang Yixizn, et al. The Study on Antitum Science and Technology Press, Beijing, 1996, 337~378.
5. Zhou Junfang, et al. The Effect of Stress on Tumor Metastasis and the Immunologic Mechanism, Cancer 1992, 11(2):107~110.
6. Cheng Qin, Antiaging Research Experimental Methods, Chinese Medical Science and Technology Press, Beijing,, 1996, 337~378.
7. Tao Yixun, et al. Clinical Immunologic Test, Shanghai Science and Technology Press, 1983:105.
8. Xy Xueying, et al. An Improved Humoral immunity Test-Hemolysin Essay, Pharmaceutical Acta 1979, 14(7):443.
9. Xu Shikai, et al. Antiaging Material Meics, 1^st edition Chinese Medical Science and Technology Press, Beijing, 1995, 164~165.
10. Li Denghua, Tian Zhigan, Zhang Jie, et al, Rapid Determination of Cytotoxicity of Drugs on Suspended Tumor Cell, 1991, 10(3):226~228.
11. Ader R. Psyvhoneuro immunology. New York, Academic Press Inc, 1981:37.
12. Tsutomu Okimura, et al. Effect of Restraintatress on Delay typer-sens-activity and Phagocytosis in Mice, Jean, J. Pharmacol, 1986, 41:229.
13. Brown Re, et al. Fatty Aids and Inhibition of Mitogen-Induced Lymphocyte Transformation by leukemic gerum. J Immunol, 1983, 131:101.

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